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艾滋HIV確診/確證實(shí)驗,免疫印跡法(蛋白條帶/蛋白膜條法)

發(fā)布日期:2022-01-10    閱讀:219    文章分類(lèi):資料中心

根據衛生部規定,HIV抗體陽(yáng)性報告必須由衛生部認證并取得資格的艾滋病病毒抗體確認實(shí)驗室出具才有法律效應。

 

最常用的HIV抗體確認實(shí)驗方法是免疫印跡法(Western Blot,WB)。

 

HIV抗體確認實(shí)驗結果的評價(jià):免疫印跡實(shí)驗的結果是根據硝酸纖維素條膜特異性HIV抗原位置上出現的帶型不同來(lái)判斷HIV抗體為陽(yáng)性、陰性和不確定。

 

HIV抗體不確定(或可疑)結果的評價(jià):在某些情況下,樣品顯示不典型的HIV反應性條帶圖譜,既不能確定為陽(yáng)性也不能確定為陰性,稱(chēng)為HIV抗體不確定或可疑陽(yáng)性。

 

[測定方法]

免疫印跡法(或蛋白印跡法)。

 

[方法學(xué)原理]

將純化的確診HIV蛋白抗原裂解,然后通過(guò)SDS-PAGE按分子量大小將其分離,再轉印至硝酸纖維素薄膜上,并保存于4℃干燥試管內,測定時(shí)將割成膜條的硝酸纖維素薄膜與待檢樣品反應,使其充分接觸。若樣品中含有HIV抗體,將會(huì )與膜條上的抗原區帶結合,再加上酶標抗人IgG抗體,經(jīng)過(guò)與底物反應顯色,即可形成肉眼可見(jiàn)的不同區帶。

 

[標本準備]

靜脈抽血2ml,不抗凝。

 

[試劑]

1、轉印有HIV I型和Ⅱ型抗原的硝酸纖維素薄膜。

2、酶聯(lián)結合物。

3、底物及底物緩沖液。

4、洗滌液。

5、穩定液。

 

[測定步驟]

1、在免疫印跡法反應槽內,加入3ml洗滌液。加入待測樣品20ul,混勻。

2、在反應槽內加入含HIV抗原的硝酸纖維素薄膜液,在室溫環(huán)境中振搖2h,每份樣品為1條。每次測定需附陰性對照、陽(yáng)性對照。在振搖過(guò)程中,應使膜條帶有號碼的一面始終保持向上。

3、傾去槽內的反應液,用洗滌液將各膜條洗5次,每次3min。

4、在各反應槽內加酶聯(lián)試劑,于室溫環(huán)境中再振搖1h,用洗滌液洗4次,最后用底物緩沖液洗1次。

5、將底物溶液配好后,加入反應槽內并振搖數分鐘,待陽(yáng)性對照出現典型的HIV抗體陽(yáng)性區帶后,迅速傾去底物溶液,并加入穩定液繼續振搖30min。然后將膜條取出,避光晾干,判斷結果。

6、結果判斷:確認試驗的結果判定可根據世界衛生組織推薦的標準,即陽(yáng)性至少1條env帶和1條pol帶;或至少1條env帶和1條、gag帶;或至少1條env帶、1條gag帶和1條pol帶;或至少2條env帶;陰性:無(wú)病毒特異帶??梢桑?條gag帶和1條pol帶,或只有g(shù)ag帶或poi帶。

 

[臨床意義]

免疫印跡法是目前公認的確診HIV感染的方法,若檢出3個(gè)HIV主要基因(gag、poi、env)產(chǎn)物的抗體為陽(yáng)性時(shí),可確診為HIV感染。

 

HIV屬于逆轉錄病毒科慢病毒屬中的人類(lèi)慢病毒組,為直徑約100~120nm球形顆粒,由核心和包膜兩部分組成。核心包括兩條單股RNA鏈、核心結構蛋白和病毒復制所必需的酶類(lèi),含有逆轉錄酶(RT,P51/P66),整合酶(INT,P32)和蛋白酶(PI,P10)。核心外面為病毒衣殼蛋白(P24,P17)。病毒的最外層為包膜,其中嵌有外膜糖蛋白(gp120)和跨膜糖蛋白(gp41)。

 

HIV基因全長(cháng)約9.8kb,含有3個(gè)結構基因(gag、pol、env)、2個(gè)調節基因(tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表達調節子)和4個(gè)輔助基因(nef負調控因子、vpr病毒r蛋白、vpu病毒u蛋白和vif毒粒感染性因子)。

 

HIV是一種變異性很強的病毒,各基因的變異程度不同,env基因變異率最高。HIV發(fā)生變異的主要原因包括逆轉錄酶無(wú)校正功能導致的隨機變異、宿主的免疫選擇壓力以及藥物選擇壓力,其中不規范的抗病毒治療是導致耐藥性的重要原因。

 

根據HIV基因差異,將其分為HIV-1型和HIV-2型,兩型間氨基酸序列的同源性為40%~60%。目前全球流行的主要是HIV-1(本方案中如無(wú)特別說(shuō)明,HIV即指HIV-1)。

 

HIV-1可進(jìn)一步分為不同的亞型,包括M亞型組(主要亞型組)、O亞型組和N亞型組,其中M組有A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K11個(gè)亞型。此外,近年來(lái)發(fā)現多個(gè)流行重組型。HIV-2的生物學(xué)特性與HIV-1相似,但其傳染性較低,引起的艾滋病臨床進(jìn)展較慢,癥狀較輕。

 

HIV-2型至少有A、B、C、D、E、F、G7個(gè)亞型。我國以HIV-1為主要流行株,已發(fā)現的有A、B(歐美B)、Bc(泰國B(niǎo))、C、D、E、F和G8個(gè)亞型,還有不同流行重組型。

 

HIV通過(guò)各種途徑進(jìn)入機體后,病毒通過(guò)粘附,穿透細胞,復制等過(guò)程完成感染。此時(shí)檢測抗-HIV常呈陽(yáng)性。蛋白條帶會(huì )出現gp160、gp41、gp120、p17、p24、p55、p31、p51、p66、p55抗原分子是一種前體分子,在HIV感染早期出現并漸漸地分解成其他核蛋白。gp160是前體分子,在感染初期產(chǎn)生,然后分解成gp120和gp41。gp41蛋白分布在病毒包膜的內外層(跨膜糖蛋白),與HIV-1分型有關(guān)。gp41與gp160共同參與病毒與宿主細胞CD4分子變體的結合。在檢測到gp160和p55時(shí),說(shuō)明病毒正在復制過(guò)程中。POL蛋白包括的p66、p51和p31,POL蛋白位于病毒的核區內,與病毒核酸緊密相關(guān)聯(lián)。病毒感染最初階段,ENV(gp160)或GAG(p24)可單獨出現,在感染初期30d,p24與gp160的強度大約會(huì )相等,當病毒感染2~3個(gè)月時(shí),ENV和GAG標記物飽和,gp160在6個(gè)月時(shí)可飽和。隨著(zhù)時(shí)間的推移,病毒過(guò)了相對的停滯期,開(kāi)始大量復制,這時(shí)出現典型蛋白條帶。

 

當一個(gè)人最近處于血清學(xué)轉型時(shí)期,很可能在測定時(shí)出現不典型的條帶類(lèi)型。處于低感染的人群,有可能出現不確定結果。有時(shí)不確定反應是由于HIV-2型的交叉反應所致,比如gp120、p60。有些與HIV-2型感染有交叉反應。個(gè)別HIV-1型感染也可出現。這是因為艾滋病的自然病種或其他的免疫缺陷所致。p24和p66的抗體會(huì )隨著(zhù)艾滋病的病程進(jìn)展而降低。另外,患有惡性腫瘤的感染者和接受免疫抑制藥物治療的感染者也有可能不出現陽(yáng)性反應。當出現不確定結果時(shí),建議感染者3~6個(gè)月進(jìn)行復檢,或檢測病毒核酸或p24抗原,以作為輔助診斷。

 

當p17出現時(shí),常伴有p24出現,僅p17出現無(wú)臨床意義。當單獨出現p68、p56、p40、p34時(shí),可排除HIV感染。對于反復凍融的血清,ELIAS法檢測抗HIV常呈陽(yáng)性,同時(shí)膠體硒快速診斷也呈陽(yáng)性,而WB呈陰性結果。